-20℃ 避光

1. 避免反复冻融。可以根据需要分装后冻存。
2. 微量试剂管装的试剂在开盖前请离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体损失！
3. 底物为DMSO溶液，冬季气温较低时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
4. 可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
5. 试剂拆封后请尽快使用完！

6个月

荧光酶标仪

活细胞

1. 荧光酶标仪
2. 离心机
3. 移液器
4. 冰箱
5. 冰盒

1. PBS缓冲液
2. （选做）阳性对照抑制剂

1. 离心管
2. 吸头
3. 一次性手套
4. 荧光专用黑色96孔板

1. 全程避光操作（荧光底物易光解），试剂现配现用。
2. 酶液稀释时轻柔操作，避免反复冻融，防止酶活性降低。
3. 全程温度一致，温度波动会显著影响酶活性。
4. 底物水解应在线性范围内（通常20分钟内），避免底物耗尽。
5. 有条件的话建议设置复孔。
6. 待测样品避免带入大量DMSO（超过 1%）。
7. 注意假阳性/假阴性：
8. 荧光淬灭: 化合物可能淬灭荧光，导致假阳性。通过设置"化合物背景"对照验证。
9. 化合物自身荧光: 化合物在相同波长下有荧光，导致假阴性。通过设置化合物对照识别。
10. 预孵育的重要性: 充分的预孵育能显著提高发现弱结合抑制剂的几率。
11. 以下步骤以待测试抑制剂化合物与底物显色反应同步进行为例。实际测试时可以先用抑制剂处理细胞，然后再用底物显色来检测抑制处理后的情况。根据自己实际需要选择模型制备方法。

电子版仅供参考，最终以试剂盒的纸质说明书为准！

试剂准备
1. 检测缓冲液A / 显色缓冲液C：直接使用，使用前需平衡至室温。
2. 底物B的准备：
在打开盖子之前，先平衡至室温，使用约 13000 rpm 的转速进行离心，20-30 s，将附着在管盖或管壁上的液体收集到管底，以避免损失。
3. 待测化合物的准备： 将待测化合物用纯水或反应缓冲液进行系列稀释。


工作液制备
1. 反应工作液制备
根据实验所需（样品、抑制剂对照、空白对照等）的数量混合足够试剂。建议按下述表格比例制备酶工作液，以保证实验一致性。
每孔需制备 50 μL HDAC 反应工作液。

2. 待测样品制备
用纯水配制不同浓度的待测化合物样品。
每孔需制备 10 μL 待测样品。



细胞准备：
1. 根据模型需要培养细胞，药物处理（已经抑制剂处理的细胞跳过“HDAC检测”的第2步“加化合物”步骤）。
2. 用冷PBS洗涤细胞2-3次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
3. 吸掉PBS，按下面步骤检测HDAC抑制情况。

HDAC检测：
1. 加反应液工作液（A+B）。
向所有实验孔、阴性对照孔和空白对照孔中加入50 µL 配制好的HDAC反应工作液（A+B）。

2. （选做）加化合物/缓冲液。
向实验孔中加入10 µL 不同浓度的化合物溶液。轻轻振荡充分混匀。

3. 反应孵育。
将反应板密封后，置于37℃避光孵育30分钟-3小时。 让抑制剂与细胞充分结合。

4. 显色。
使用多通道移液器，向所有孔中快速加入40 µL（或50 µL，已经药物处理细胞，未加10 µL药物时） Developer显色缓冲液C。将孔板置于摇床，室温避光 500~700rpm 振荡 30~60 秒，确保体系混匀。

5. 在37℃避光孵育30分钟-2小时。荧光检测。
可以动力学检测或者终点检测。
动力学检测（优先推荐）：加好样混匀后15 min后上机将微孔板放入预温至37℃的荧光酶标仪中，开始动力学监测。
设定参数：激发光360 nm，发射光460 nm，每1-2分钟读取一次荧光强度值（RFU），持续30-60分钟。
也可以采用终点法检测：孵育 1–2 h 后读值。

可以用终点法检测吗？
可以。如果只需要简单判断不同有明显抑制差异的化合物的抑制能力高低，也可以采用终点法检测。在反应进行到某个特定时间点（如30分钟）时，读取一次荧光值进行比较。
根据终点荧光强度值进行比较。